اصل روش و کاربردها
آزمون MTT یک روش رنگ‌سنجی است که زندهمانی و سمیت سلولی را از روی فعالیت آنزیمی میتوکندری اندازه می‌گیرد. در سلولهای زنده، آنزیم‌های دهیدروژناز میتوکندریایی نمک تترازولیوم زرد MTT را به کریستال‌های بنفش فورمازان احیا می‌کنند. مقدار فورمازان تولیدشده با تعداد سلولهای زنده متناسب است. کریستال‌ها پس از حل شدن در حلال مناسب، جذب نوری در طول موج حدود ۵۷۰ نانومتر ایجاد می‌کنند که با دستگاه الایزا ریدر خوانده می‌شود. این آزمون در غربالگری ترکیبات دارویی، عصاره‌های گیاهی، نانومواد و مواد زیستی به‌کار می‌رود و نتیجه آن مبنای محاسبه غلظت‌های مؤثر است.
آزمون MTT از خدمات آزمایشگاهی تهران در حوزه سمیت‌شناسی سلولی است و آزمایشگاه زیست‌فناوری دستوا آن را با رده‌های سلولی استاندارد و پروتکل معتبر انجام می‌دهد. برای آشنایی با سایر روش‌ها، کاتالوگ آزمون‌های آزمایشگاهی را ببینید.
مراحل انجام آزمون
مسیر کار از کشت سلول تا خواندن جذب چنین است:
- کشت سلول در پلیت ۹۶ خانه تا رسیدن به تراکم مناسب و ورود به فاز رشد لگاریتمی
- تیمار سلولها با غلظت‌های سریالی ماده مورد آزمون به مدت ۲۴ تا ۷۲ ساعت
- افزودن محلول MTT و انکوباسیون ۲ تا ۴ ساعت در انکوباتور CO2
- حل کردن کریستال‌های فورمازان با DMSO یا حلال مناسب دیگر
- خواندن جذب در حدود ۵۷۰ نانومتر و محاسبه درصد زندهمانی نسبت به چاهک‌های کنترل
تفسیر نتایج
زندهمانی به‌صورت درصد نسبت به کنترل بدون تیمار گزارش می‌شود. از منحنی دوز-پاسخ، غلظت مهاری ۵۰ درصد یا IC50 محاسبه می‌شود؛ هرچه IC50 کوچکتر باشد، ماده سمی‌تر است. دسته‌بندی متداول نتایج چنین است:
| درصد زندهمانی نسبت به کنترل | تفسیر معمول |
|---|---|
| بالای ۹۰ درصد | سمیت معنی‌دار در غلظت آزموده‌شده دیده نمی‌شود |
| بین ۵۰ تا ۹۰ درصد | سمیت خفیف تا متوسط؛ تکرار آزمون و بررسی وابستگی به دوز لازم است |
| کمتر از ۵۰ درصد | سمیت قابل توجه؛ غلظت مؤثر از منحنی دوز-پاسخ محاسبه می‌شود |
مقایسه IC50 بین آزمایش‌ها فقط زمانی معتبر است که رده سلولی، زمان تیمار و تعداد سلول اولیه یکسان باشد.
نکات عملی کنترل کیفیت
اگر این داده‌ها بخشی از پایان‌نامه شماست، راهنمای تحلیل آماری نتایج آزمایشگاهی در پایان‌نامه را مطالعه کنید.
- در هر پلیت چاهک کنترل منفی (بدون تیمار) و شاهد حلال در نظر بگیرید.
- سلولها باید در فاز رشد لگاریتمی باشند؛ سلولهای پیر یا بیش‌ازحد متراکم خطا ایجاد می‌کنند.
- هنگام خواندن، از ایجاد حباب در چاهک‌ها پرهیز کنید.
- برای ترکیبات رنگی یا احیاکننده، نتیجه را با روش مکمل مانند LDH یا رنگ‌آمیزی تریپان بلو کنترل کنید.
- هر غلظت را دست‌کم در سه چاهک تکرار کنید و نتایج را با انحراف معیار گزارش دهید.
سفارش این آزمون از دستوا
تیم خدمات کشت سلولی زیست‌فناوری دستوا آزمون MTT را با گزارش استاندارد، ذکر رده سلولی و زمان تحویل مشخص انجام می‌دهد. برای اطلاع از تعرفه و ثبت سفارش، از طریق فرم درخواست پیش‌فاکتور اقدام کنید.