اصول روش و اساس جذب نور
در اسپکتروفتومتری UV-Vis برهم‌کنش نور فرابنفش و مرئی (تقریباً ۱۹۰ تا ۸۰۰ نانومتر) با ماده سنجیده می‌شود. مولکول‌های دارای کروموفور مانند حلقه‌های آروماتیک و پیوندهای مزدوج، نور را در طول‌موج‌های مشخصی جذب می‌کنند و الکترون‌هایشان به تراز انرژی بالاتر می‌روند. هر ترکیب الگوی جذبی ویژه خود را دارد و شدت جذب با غلظت نسبت مستقیم دارد؛ همین رابطه مبنای سنجش کمّی است.
قانون بیر-لامبرت و محدوده خطی
قانون بیر-لامبرت رابطه میان جذب و غلظت را تعریف می‌کند: A = εbc که در آن ε ضریب جذب مولی، b طول مسیر نوری بر حسب سانتی‌متر و c غلظت است. جذب از نسبت شدت نور ورودی به خروجی طبق رابطه A = log(I₀/I) به دست می‌آید.
در عمل برای هر آزمون منحنی کالیبراسیون با استانداردهای مشخص رسم می‌شود و غلظت نمونه مجهول از آن خوانده می‌شود. جذب بالاتر از حدود ۱ از ناحیه خطی خارج می‌شود؛ نمونه‌های غلیظ را باید رقیق کرد تا پاسخ در محدوده خطی بماند.
اجزای دستگاه و آماده‌سازی نمونه
دستگاه تک‌پرتویی ساده از منبع نور، مونوکروماتور، جایگاه کووت و آشکارساز تشکیل می‌شود. لامپ دوتریوم ناحیه فرابنفش و لامپ تنگستن-هالوژن ناحیه مرئی را پوشش می‌دهد.
کیفیت نتیجه بیش از هر چیز به آماده‌سازی نمونه وابسته است. محلول باید شفاف و بدون ذرات معلق باشد؛ کدورت و حباب، نور را پراکنده می‌کنند و جذب را بیش از مقدار واقعی نشان میدهند. حلال انتخابی نیز نباید در ناحیه اندازه‌گیری جذب داشته باشد.
- انتخاب کووت مناسب: کوارتز برای ناحیه UV، شیشه یا پلاستیک فقط برای مرئی
- صفر کردن دستگاه با شاهد (بلانک) و ثبت طیف زمینه
- پرکردن یکنواخت کووت‌ها و پاک‌کردن سطح بیرونی از اثر انگشت
- رقیق‌سازی نمونه‌های غلیظ تا ورود به محدوده خطی قانون بیر-لامبرت
کاربردهای رایج در آزمایشگاه
این روش پایه بسیاری از سنجش‌های کمّی روزمره در آزمایشگاه است. در خدمات آزمایشگاهی دستوا از آن برای اندازه‌گیری غلظت DNA و RNA در ۲۶۰ نانومتر، بررسی خلوص با نسبت ۲۶۰/۲۸۰، سنجش پروتئین، اندازه‌گیری نیتریت و رنگ در مواد غذایی و آزمون‌های آنتی‌اکسیدانی استفاده می‌شود. نمونه‌های رایج در کاتالوگ آزمون‌ها قابل مشاهده‌اند.
| حوزه کاربرد | هدف سنجش | نکته عملی |
|---|---|---|
| زیست مولکولی | غلظت DNA و RNA در ۲۶۰ نانومتر | نسبت ۲۶۰/۲۸۰ معیار خلوص |
| پروتئین‌سنجی | جذب ۲۸۰ نانومتر یا روش برادفورد | انتخاب روش بر اساس حساسیت موردنیاز |
| مواد غذایی | نیتریت، رنگ‌ها و مواد نگهدارنده | مقایسه با حد مجاز بر اساس استاندارد ملی مربوطه |
| تحقیقات آنتی‌اکسیدانی | آزمون DPPH و مشابه آن | ثبت تغییرات جذب در طول زمان |
مزایا و محدودیت‌ها
این روش سریع، کم‌هزینه و غیر مخرب است و نمونه پس از آزمون قابل بازیابی است؛ برای غربالگری روزانه QC گزینه نخست محسوب می‌شود. اما طیف UV-Vis اطلاعات ساختاری محدودی می‌دهد و برای شناسایی ساختار شیمیایی باید سراغ روش‌های مکمل مانند طیف‌سنجی FTIR رفت. ترکیبات بدون کروموفور نیز بدون مشتق‌سازی قابل اندازه‌گیری نیستند.
- مزیت: سرعت بالا و هزینه پایین برای سنجش روتین
- مزیت: غیر مخرب بودن و امکان بازیابی نمونه
- محدودیت: حساسیت به کدورت، حباب و تداخل زمینه
- محدودیت: ناتوانی در شناسایی مستقیم ساختار شیمیایی
سفارش این آزمون از دستوا
تیم زیست‌فناوری دستوا آزمون اسپکتروفتومتری UV-Vis را با دستگاه‌های کالیبره‌شده و مطابق پروتکل‌های استاندارد انجام می‌دهد و گزارش نتایج را همراه با منحنی کالیبراسیون تحویل می‌دهد. برای دریافت تعرفه و زمان تحویل، فرم درخواست پیش‌فاکتور را پر کنید.