کیفیت RNA حرف اول را می‌زند
در qPCR، نمونه تخریب‌شده یعنی Ct بالا، تکرارپذیری پایین و گاهی نتیجه منفی کاذب. آماده سازی نمونه qPCR از استخراج شروع می‌شود، نه از چیدن واکنش در پلیت؛ کیفیت پایین RNA را هیچ تنظیم سخت‌افزاری جبران نمی‌کند.
مبانی استخراج را در راهنمای استخراج RNA و اصول سنجش را در راهنمای جامع qPCR مرور کنید. این چک‌لیست بر اساس تجربه تیم دستوا با نمونه‌های پژوهشی واقعی تنظیم شده است.
استخراج RNA و کنترل کیفیت
پس از استخراج، این شاخص‌ها را ثبت کنید و خارج از بازه‌ها را جدی بگیرید:
| شاخص | مقدار مطلوب | چه چیزی را نشان میدهد |
|---|---|---|
| نسبت ۲۶۰ به ۲۸۰ | حدود ۱٫۸ تا ۲٫۰ | خلوص از پروتئین |
| نسبت ۲۶۰ به ۲۳۰ | بالاتر از ۱٫۸ | نبود نمک و فنل باقی‌مانده |
| ژل یا Bioanalyzer | باندهای واضح rRNA | سلامت و یکپارچگی RNA |
| غلظت | بر اساس نیاز سنجش | برنامه‌ریزی رقت‌ها |
درمان DNase و تبدیل به cDNA
اگر استخراج RNA شما همراه با DNA ژنومی باشد، سیگنال برخی سنجش‌ها کاذب بالا می‌رود. درمان DNase طبق دستورالعمل کیت و غیرفعال‌سازی کامل آنزیم پیش از واکنش، از این خطا جلوگیری میکند.
سپس RNA را به cDNA تبدیل کنید؛ مقدار RNA ورودی و حجم واکنش را بر اساس دستورالعمل کیت انتخاب کنید. cDNA را در دمای مناسب نگهداری کنید و از انجماد و ذوب مکرر بپرهیزید.
طراحی پرایمر درست
پرایمر بد، منحنی ذوب غیراختصاصی و راندمان خارج از بازه میدهد. هنگام طراحی پرایمر این موارد را رعایت کنید:
- طول ۱۸ تا ۲۵ نوکلئوتید و محتوای GC حدود ۴۰ تا ۶۰ درصد
- دمای ذوب نزدیک به هم برای پرایمرهای رفت و برگشت
- محصول تکثیر ۷۰ تا ۱۵۰ جفت‌باز برای qPCR
- طراحی روی مرز اگزون–اینترون در صورت امکان، برای حذف سیگنال DNA ژنومی
- بررسی راندمان با منحنی استاندارد؛ بازه ۹۰ تا ۱۱۰ درصد قابل قبول است
چک‌لیست پیش از اجرا
این چند مورد را قبل از شروع هر اجرا کنترل کنید:
- کار روی سطح تمیز در محیط بدون RNase و تعویض مداوم دستکش
- آماده‌سازی مستر میکس بر اساس تعداد واکنش‌ها به اضافه درصدی ذخیره
- گنجاندن کنترل منفی بدون الگو و کنترل مثبت در هر پلیت
- ثبت تکرارهای فنی بر اساس دستورالعمل سنجش و بررسی انحراف آن‌ها
سفارش این خدمت از دستوا
اگر RNA شما ارزشمند و تکرارناپذیر است، اجرای qPCR را به دستوا بسپارید. خدمات آزمایشگاهی تهران برای استخراج و سنجش بیان ژن را در کاتالوگ آزمون‌ها ببینید و با درخواست پیش‌فاکتور شروع کنید.