اصل کار: سیگنال در هر چرخه
qPCR (Real-Time PCR) تکثیر DNA را در هر چرخه با سیگنال فلورسانس دنبال می‌کند. هرچه نسخه‌های الگوی اولیه بیشتر باشد، سیگنال زودتر از خط آستانه عبور می‌کند؛ به این چرخه Ct می‌گویند.
رابطهٔ Ct با لگاریتم مقدار اولیه خطی است؛ منحنی استاندارد ساخته‌شده از رقت‌های سریالی، بازده واکنش را نشان میدهد و اساس کمّی‌سازی است. خروجی qPCR عدد است، نه باند روی ژل.
دو شیمی اصلی تشخیص
برای دیدن محصول تکثیر، دو راه رایج است: رنگ اتصال‌دهنده به DNA دو رشته‌ای یا پروب نشان‌داری که هنگام طویل‌سازی بریده می‌شود.
| ویژگی | SYBR Green | پروب TaqMan |
|---|---|---|
| مکانیسم سیگنال | اتصال به DNA دو رشته‌ای | برش پروب نشان‌دار در حین طویل‌سازی |
| اختصاصیت | وابسته به پرایمر؛ با منحنی ذوب بررسی می‌شود | بالا؛ توالی‌اختصاصی است |
| تشخیص چند هدف هم‌زمان | محدود | ممکن با رنگ‌های متفاوت |
| هزینهٔ معرف‌ها | کمتر | بیشتر |
آماده‌سازی نمونه و طراحی آزمایش
- کیفیت اسید نوکلئیک نقطهٔ شروع است؛ نکات عملی در راهنمای استخراج DNA آمده است.
- برای سنجش بیان ژن، cDNA را از مقدار RNA یکسان بسازید تا مقایسهٔ بین نمونه‌ها معتبر بماند.
- پرایمر را روی مرز دو اگزون طراحی کنید تا DNA ژنومی تقویت نشود.
- کنترل بدون الگو (NTC) و تکرار تکنیکی سه‌تایی برای هر نمونه بگذارید.
- ژن خانه‌دار را از نظر پایداری بیان در بافت خودتان پیش از کار اصلی بررسی کنید.
کاربردهای واقعی
- سنجش نسبی بیان ژن با روش ΔΔCt در سلول‌ها و بافت‌های مختلف
- شمارش کپی ژن و بررسی ژنوتایپ در نمونه‌های پژوهش
- شناسایی و کمّی‌سازی میکروارگانیسم‌ها در کنترل کیفی مواد غذایی
- ردیابی ارگانیسم‌های دستکاری‌شدهٔ ژنتیکی در مواد غذایی و بذر
- بررسی حضور تراژن در رده‌های سلولی تراریخته در مطالعات پایه
محدودیت‌ها و نکات تکرارپذیری
حساسیت بالای qPCR یعنی آلودگی هم سریع تکثیر می‌شود؛ محلول‌ها، پیپت‌ها و پلیت‌ها را از ناحیهٔ محصول جدا نگه دارید و کنترل منفی را جدی بگیرید. دایمر پرایمر با منحنی ذوب آشکار می‌شود.
مقایسهٔ بین آزمایش‌ها فقط با ژن مرجع ثابت و شرایط اجرای یکسان معتبر است. کمّی‌سازی مطلق هم بدون منحنی استاندارد معتبر ممکن نیست؛ در آزمایشگاه دستوا این الزام‌ها برای هر ران رعایت می‌شود.
تکرار تکنیکی و زیستی را از ابتدای طرح پژوهشی در نظر بگیرید؛ هزینهٔ بازگشت از داده‌های ناقص بیشتر از هزینهٔ تکرار است.
سفارش این آزمون از دستوا
اگر در تهران دنبال خدمات qPCR هستید، آزمایشگاه زیست مولکولی دستوا — از ارائه‌دهندگان خدمات آزمایشگاهی تهران — طراحی پرایمر، استخراج اسید نوکلئیک و گزارش تفسیری ارائه میدهد. پژوهشگران می‌توانند از راهنمای آنالیز پایان‌نامه هم استفاده کنند. برای شروع، درخواست پیش‌فاکتور ثبت کنید یا کاتالوگ آزمون‌ها را ببینید.