یک موتور مشترک، دو شیوهٔ خواندن
PCR معمولی و qPCR هر دو بر پایهٔ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کار می‌کنند: دناتوراسیون در حدود ۹۵ درجه سلسیوس، اتصال پرایمر و طویل‌سازی با پلیمراز مقاوم به حرارت. چرخه‌های دمایی و اجزای واکنش تقریباً یکسان‌اند.
تفاوت در لحظهٔ خواندن نتیجه است؛ PCR معمولی محصول را پس از پایان چرخه‌ها نشان می‌دهد و qPCR در هر چرخه سیگنال می‌گیرد. به زبان ساده، سؤال پژوهش تعیین می‌کند که خواندن در پایان واکنش کافی است یا باید تکثیر را حین اجرا دنبال کنید.
جزئیات روش دوم در راهنمای qPCR آمده است.
اندپوینت در برابر زمان واقعی
خروجی PCR معمولی باندی روی ژل آگارز است؛ حضور، غیاب و تقریبی از اندازهٔ محصول را می‌بینید. کمّیسازی روی ژل با دانسیتومتری انجام میشود و دقت محدودی دارد.
در qPCR هر چرخه یک عدد فلورسانس ثبت میشود؛ Ct با لگاریتم مقدار الگوی اولیه رابطهٔ خطی دارد، بنابراین خروجی مستقیماً قابل کمّیسازی است و به ژل نیاز ندارید.
جدول مقایسه
خلاصهٔ تفاوت‌ها در یک نگاه:
| معیار | PCR معمولی | qPCR |
|---|---|---|
| زمان خواندن | پایان واکنش | هر چرخه |
| آشکارسازی | ژل آگارز و رنگ‌آمیزی | فلورسانس |
| نوع خروجی | کیفی | کمّی |
| هزینهٔ اجرا | کمتر | بیشتر |
| ریسک آلودگی پس از واکنش | باز شدن لوله برای ژل | کمتر |
انتخاب بر اساس سؤال پژوهش
- کلونینگ، تعیین توالی و بررسی ژنوتایپ: PCR معمولی کافی و ارزان است.
- سنجش بیان ژن و شمارش کپی: بدون qPCR عملاً ممکن نیست.
- غربالگری ده‌ها نمونه: qPCR با صفحهٔ ۹۶ چاهکی سریع‌تر تمام میشود.
- سؤال بله یا خیر با بودجهٔ محدود: PCR معمولی انتخاب منطقی‌تر است.
- مقایسهٔ نیمه‌کمّی چند نمونه با ژل هم ممکن است؛ اما وقتی نتیجه باید عدد باشد، qPCR تنها راه درست است.
- در آزمایشگاه دستوا روش بر اساس سؤال پژوهش پیشنهاد میشود، نه عادت آزمایشگاه.
نکات عملی مشترک
نکاتی که در هر دو روش مشترک‌اند:
- طراحی پرایمر، کیفیت DNA و کنترل‌های مثبت و منفی؛ اگر کار از استخراج شروع میشود، راهنمای استخراج DNA را ببینید.
- qPCR به پلیت اپتیکی و مسترمیکس فلورسانس‌دار نیاز دارد؛ حباب هوا در چاهک خطای رایجی است.
- در PCR معمولی می‌توانید حجم واکنش را برای برش آنزیمی یا کلونینگ بزرگ‌تر بگیرید.
- در بخش زیست مولکولی دستوا، هر دو روش با کنترل کیفی داخلی اجرا میشود.
سفارش این آزمون از دستوا
اگر مطمئن نیستید PCR یا qPCR برای پژوهش شما کافی است، هدف و نوع نمونه را برای کارشناسان دستوا (dastva-zist) بنویسید تا روش پیشنهاد دهند. برای برآورد هزینه درخواست پیش‌فاکتور بدهید یا کاتالوگ آزمون‌ها را مرور کنید.