اصل روش: توقف زنجیره و جداسازی بر اساس اندازه
اساس روش سانگر توقف تصادفی ساخت رشتهٔ DNA است. نوکلئوتید دی‌دئوکسی (ddNTP) با برچسب فلورسانت گروه هیدروکسیل ۳′ ندارد و پس از اتصال، سنتز رشته را متوقف می‌کند؛ نتیجه مجموعه‌ای از قطعات است که هر کدام به یک باز مشخص ختم می‌شوند.
قطعات با الکتروفورز مویرگی بر اساس اندازه جدا می‌شوند و لیزر رنگ هر قطعه را می‌خواند؛ ترتیب رنگ‌ها همان تعیین توالی DNA است. خروجی واکنش کروماتوگرام است و ارتفاع و فاصلهٔ پیک‌ها کیفیت هر باز را نشان می‌دهد.
قدرت و محدودیت‌های روش
سانگر خوانش قابل اتکای ۸۰۰ تا ۹۰۰ جفت‌باز از هر آغازگر می‌دهد؛ نواحی ابتدا و انتها معمولاً کیفیت پایین‌تری دارند و در تحلیل حذف می‌شوند. دقت هر باز بالاست، اما توان عملیاتی محدود است و برای پرسش‌های ژنوم‌وسیع مقرون‌به‌صرفه نیست.
- دقت بالا در هر باز: انتخاب اول برای تأیید نتیجه
- نیاز به آغازگر اختصاصی و توالی مرجع در دو طرف ناحیهٔ هدف
- محدودیت در خوانش هم‌زمان تعداد زیاد نمونه
کاربردهای رایج در آزمایشگاه و صنعت
تأیید کلون‌ها و سازه‌های ژنی، بررسی جهش‌های نقطه‌ای شناخته‌شده، تعیین هویت گونه‌ها با ژن‌های بارکد و بازبینی نتایج پنل‌های نسل جدید از کاربردهای اصلی این روش است. در پروژه‌های سنتز ژن، سازهٔ تحویلی پیش از هر آزمایش پایین‌دستی با همین روش کنترل میشود. دانشجویان نیز پیش از آزمایش‌های بیان ژن به این تأیید نیاز دارند.
آماده‌سازی نمونه و آغازگر
بیشتر شکست‌های توالییابی به قالب آلوده، غلظت نادرست یا آغازگر نامناسب برمی‌گردد؛ مقادیر پیشنهادی را رعایت کنید.
| مورد | توصیه |
|---|---|
| محصول PCR | ۱۰ تا ۵۰ نانوگرم، بدون آغازگر و dNTP اضافی |
| پلاسمید | ۳۰۰ تا ۵۰۰ نانوگرم با خلوص بالا |
| آغازگر | طول ۱۸ تا ۲۵ نوکلئوتید، محتوای GC حدود ۴۰ تا ۶۰ درصد |
| نسبت جذب | ۲۶۰/۲۸۰ نزدیک ۱٫۸ و بدون آلودگی RNA |
سانگر یا نسل جدید؟
برای چند ناحیهٔ مشخص، سانگر سریع‌تر و کم‌هزینه‌تر تمام میشود؛ وقتی هدف پروفایل ژنومی گسترده باشد، توالییابی نسل جدید منطقی‌تر است و سانگر نقش تأییدکننده پیدا می‌کند. برای انتخاب درست، کاتالوگ آزمون‌های دستوا را ببینید یا از کارشناسان خدمات آزمایشگاهی مشاوره بگیرید.
سفارش این آزمون از دستوا
آزمایشگاه زیست‌فناوری دستوا توالییابی سانگر را روی پلاسمید، محصول PCR و نمونهٔ باکتریایی انجام می‌دهد؛ فایل توالی و آغازگر را همراه نمونه ارسال کنید. برای دریافت زمان تحویل و هزینه، فرم درخواست پیش‌فاکتور را تکمیل کنید.