وسترن بلات چیست؟
وسترن بلات روش استاندارد شناسایی پروتئین خاص در مخلوط پیچیده است. پروتئین‌ها ابتدا با الکتروفورز SDS-PAGE بر اساس اندازه جدا می‌شوند، سپس روی غشا منتقل شده و با آنتیبادی اختصاصی شناسایی می‌شوند.
سیگنال نهایی از آنتیبادی ثانویه نشاندار با آنزیم یا فلوروفور تولید و به‌صورت باند ثبت می‌شود. موقعیت باند نسبت به نشانگر وزن مولکولی، هویت پروتئین را تأیید میکند.
مراحل اجرا، گام‌به‌گام
شش مرحله به ترتیب اجرا می‌شود؛ اجرای صحیح هر مرحله، شرط رسیدن به باند خوانا است:
- لیز سلول یا بافت در بافر حاوی مهارکننده پروتئاز و تعیین غلظت پروتئین
- الکتروفورز SDS-PAGE برای جداسازی پروتئین‌ها بر اساس اندازه
- انتقال الکتریکی به غشا با سیستم تر یا نیمه‌خشک
- بلوکینگ با پروتئین خنثی برای مهار اتصال غیراختصاصی
- انکوباسیون با آنتیبادی اولیه و سپس آنتیبادی ثانویه نشاندار
- ظهور با سوبسترای شیمی‌لومینسانس یا کروموژن و ثبت تصویر
انتخاب غشا و آنتیبادی
کیفیت آنتیبادی اولیه مهم‌ترین عامل موفقیت وسترن بلات است؛ آنتیبادی با واکنش متقاطع بالا باندهای اضافه می‌دهد و نتیجه را غیرقابل تفسیر میکند. رقت بهینه را پیش از آزمایش اصلی با یک چاهک آزمایشی تعیین کنید.
| ویژگی | نیتروسلولز | PVDF |
|---|---|---|
| آماده‌سازی | بدون فعال‌سازی | نیازمند فعال‌سازی با متانول |
| مقاومت مکانیکی | شکننده | مقاوم؛ مناسب سترپینگ |
| پس‌زمینه سیگنال | پایین | بدون بلوکینگ کافی بالاتر |
کنترل کیفیت و نکات عملی
چهار نکته که کیفیت نهایی باندها را تعیین می‌کنند:
- پروتئین خانهدار مانند بتا-اکتین را به‌عنوان کنترل بارگذاری هم‌زمان سنجش کنید.
- انتقال را با رنگ پونسو بررسی کنید تا پیش از انکوباسیون آنتیبادی از موفقیت مطمئن شوید.
- برای مقایسه کمی نمونه‌ها، شدت باند را نسبت به کنترل بارگذاری نرمالسازی کنید.
- باند با اندازه غیرمنتظره لزوماً خطا نیست؛ ایزوفرم یا برش پروتئولیتیک را هم در نظر بگیرید.
کاربردها و محدودیت‌ها
در آنالیز پروتئین پژوهش‌های زیست مولکولی، وسترن بلات برای بررسی بیان پروتئین نوترکیب، تغییرات فسفریلاسیون و اثر تیمارها بر مسیرهای سیگنالی به کار می‌رود. برخلاف ELISA که پروتئین را در محلول می‌سنجد، وسترن بلات اندازه مولکولی را هم نشان می‌دهد و ویژگی آنتیبادی را تأیید میکند.
محدودیت روش، زمان‌بر بودن و ماهیت نیمه‌کمی آن است. اگر به سنجش کمی محلول نیاز دارید، راهنمای آزمون ELISA را بخوانید.
سفارش آزمون وسترن بلات از دستوا
کارشناسان زیست‌فناوری دستوا مراحل کامل وسترن بلات را از تهیه لیز تا آنالیز تصویر انجام می‌دهند؛ این آزمون بخشی از خدمات آزمایشگاهی ماست و گزارش شامل تصویر غشا و سنجش نیمه‌کمی است. فهرست کامل آزمون‌ها در کاتالوگ آزمون‌ها در دسترس است.
برای هماهنگی آنتیبادی و تعداد نمونه، فرم درخواست پیش‌فاکتور را پر کنید؛ پروژه‌های چندمرحله‌ای را هم از صفحه خدمات دستوا دنبال کنید.